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MECANISMES MOLECULAIRES DE LA LIBERATION DE NEUROTRANSMETTEURS
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RESPONSABLE : EL FAR Oussama

MEMBRES ACTUELS :

THEMES DE RECHERCHE :


Nous nous intéressons principalement aux mécanismes moléculaires de la libération de neurotransmetteur et de sa sensibilité calcique.
La libération de neurotransmetteurs à partir des terminaisons nerveuses est un processus calcium dépendant permettant aux neurones de communiquer chimiquement avec leurs voisinages. Les molécules de neurotransmetteurs sont chargées et stockées d’une manière active dans les vésicules synaptiques. Ces dernières sont stockés à quelques centaines d'angströms de la membrane presynaptique. Des vésicules synaptiques arrimées à la surface des membranes presynaptiques dans des domaines appelés « zones actives » alterne entre libération de leurs contenu par fusion avec la membrane et recyclage par bourgeonnement. Les vésicules synaptiques qui s'approchent de la membrane plasmique subissent une maturation qui les prépare à la fusion. Cette maturation concerne principalement l'assemblage des complexes protéiques à l'interface entre les compartiments destinés à fusionner.
Un ensemble de protéines spécialisées dénommées SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor Attachment protein REceptor) est considéré comme la machinerie minimale de fusion membranaire. Ces dernières sont spécifiquement clivées par les neurotoxines Tétaniques et Botuliques. L’assemblage de la protéine SNARE vésiculaire (v-SNARE) synaptobrévine ou VAMP2 avec un complexe des t-SNARE membranaires syntaxine et SNAP-25 est capable de provoquer, in vitro, la fusion des membranes des protéoliposomes. La synaptotagmine est un senseur calcique clé dans la libération de neurotransmetteurs. Elle stimule la fusion SNARE dépendante des protéoliposomes mais son action est antagonisée par le senseur calcique ubiquitaire “calmoduline” (Figure 1).
 
Malgré une quantitéSNARE complexe & Calcium sensors très importante de détails moléculaires disponible dans la littérature, les mécanismes précis à la base de la fusion membranaire demeurent flous. Une étape importante dans la fusion membranaire est la formation d’un pore de fusion, une structure en forme de canal reliant l’intérieur de la vésicule à la fente synaptique permettant ainsi aux molécules de neurotransmetteurs vésiculaires de diffuser en dehors de la terminaison. Cependant, la nature moléculaire du pore de fusion reste débattue. L’assemblage des proteins SNAREs rapproche les membranes et pourrait générer suffisamment d’énergie pour contrebalancer la répulsion des lipides des deux membranes opposées et provoquer mécaniquement leur mélange. Alternativement,  l’assemblage du complexe SNARE pourrait servir comme un échafaudage à l’assemblage d’une structure protéique capable par la suite d’aboutir à la formation d’un canal ou de catalyser un arrangement lipidique aboutissant à la formation d’un pore.

La V-ATPase (ATPase à proton vacuolaire) est un géant nano-moteur mutli-moléculaire présent dans toutes les cellules eucaryotes. Elle est composée de l’association réversible de deux secteurs multi-moléculaires : un secteur extra-membranaire V1 qui hydrolyse l’ATP et un secteur transmembranaire V0 qui transporte les protons. La fonction primaire de ce nano-moteur est le transport actif (ATP-dépendant) de proton. Elle acidifie les compartiments intracellulaires et joue un rôle important dans de nombreux processus physiologiques. Chez les mammifères, le secteur V0 est composé de six sous-unités c extrêmement hydrophobes (5 sous-unités c et une sous unité c’’) et d’une copie des sous-unités a, d et e.
Le couplage entre l’hydrolyse de l’ATP et le transport de proton par la V-ATPase joue un rôle crucial dans l’acidification des vésicules synaptiques et ainsi dans leur charge en neurotransmetteurs.
V0, SNAREs and calcium sensors

La V-ATPase est aussi présente à la surface membranaire de nombreux types cellulaires. A la surface des neurones, elle est impliquée dans la régulation de l’endocytose suite à des stimulations de haute fréquence.
Cependant, indépendamment de son rôle dans le transport actif de proton, il s’est dégagé ces dernières années un rôle du secteur V0 de la V-ATPase dans la libération SNARE-dépendante de neurotransmetteurs. Des composants du secteur V0 de la V-ATPase interagissent avec les protéines SNAREs et interfèrent avec l’exocytose (Figure 2).





PROJETS :

Nos projets se concentrent sur les aspects suivants :

• L’implication fonctionnelle du couplage entre le secteur V0 de la V-ATPase et le complexe SNARE dans le contrôle de la libération de neurotransmetteurs.

• La co-régulation de la fusion membranaire SNARE dépendante par les deux senseurs calciques : calmoduline et synaptotagmine.

Méthodes
Nous utilisons un large spectre de techniques biochimiques pour étudier et cartographier les interactions protéiques. Nous utilisons les bactéries ainsi que les systèmes d’expression chez les insectes afin de produire nos différentes protéines recombinants. Des expériences de purifications par affinité et de reconstitutions protéiques dans des protéoliposomes sont pratiquées en routine au laboratoire.
Les mécanismes de fusion membranaire ainsi que la libération de neurotransmetteurs sont examinés respectivement en utilisant la fusion des proteoliposomes in vitro et l’enregistrement électrophysiologique à partir de culture de neurones d’hippocampe et de ganglion cervical supérieur (SCG).

Collaborations

Interne:
Notre groupe entretient une collaboration interne avec l’équipe de Dominique Debanne (INSERM UMR1072) et notamment sur le sujet suivant :
Les canaux potassiques de type Kv1 jouent un rôle important dans la régulation des propriétés du neurone tel que son excitabilité, la conduction axonale et la force synaptique. Ces canaux sont régulés par la LGI1 (leucine-rich, glioma-inactivated 1 protein), une glycoprotéine soluble secrétée par le neurone et impliqués dans deux maladies neurologiques : l’épilepsie de lobe temporel latérale dominante autosomale (ADTLE) et l’encéphalite limbique (EL). Dans le cas d’ADTLE, il s’agit d’une forme monogénique d’épilepsie dans laquelle des mutations dans le gène codant pour la LGI1 provoquent des crises d’épilepsies accompagnées d’aura auditifs chez la majorité des patients. Dans le cas de l’encéphalite limbique, l’autoimmunité se solde par la présence chez un grand nombre de patients d’auto-anticorps dirigés contre la LGI1 et l’épilepsie est associée à des perturbations psychiatriques ainsi qu’à des pertes de mémoire. La LGI1 interagit avec les metalloprotéases ADAM22 et 23. Elle est présente dans des complexes synaptiques multi-moléculaires incluant les canaux Kv1 et les récepteurs AMPA.
Nous sommes particulièrement intéressés par les effets de la présence de LGI1 et celle  de ces auto-anticorps sur la régulation des canaux Kv1 et les conséquences sur la transmission synaptique.
Ce projet a reçu le support financier de l’ANR (REPREK).

Externe:
Nous entretenons des collaborations avec les laboratoires des professeurs Andreas Mayer à l'université de Lausanne http://www.unil.ch/ib/page9494.html, Peter Robin Hiesinger au centre médical Southwestern, Texas, USA http://fly.swmed.edu/ et le Professeur Sumiko Mochida (Tokyo Medical University) sur l’étude des mécanismes moléculaires de la transmission synaptique en utilisant les cultures neuronales du ganglion cervical supérieur (SCG) de rat. Nous collaborons aussi avec le Dr. Tibor Pali, (Institute of Biophysics, Szeged, Hongrie) sur les relations structure/fonction de la sous unité c de la V-ATPase.


FINANCEMENTS :


ANCIENS MEMBRES :

AMENDOLA Julien, BRECHET Aline, DE SAN FELICIANO Marina , DRIHEM Chiraz, ERARD-GARCIA Madeleine, GOUGOT Julie, LEVY Annie , SAMARI Nada, VAN RENTERGHEM Catherine.

PUBLICATIONS :


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